Hacia 1526, Sebastián Gaboto, llegaba a las costas del sur de América con el encargo recibido de la corona española de continuar la exploración hacia el oeste atravesando el estrecho descubierto por Magallanes en busca de las islas de las Especerías. Pero el navegante veneciano, ya Piloto Mayor del Reino, al llegar a estas costas, impactado por relatos sobre una tierra llena de riquezas, a las que se llegaba ingresando por la boca de aquel "mar dulce" descubierto por Solís –en realidad el ancho río al que se conocería desde entonces como de la Plata– decide internarse en él y explorándolo descubre la embocadura de otro: el Paraná. Navega por éste hacia el norte hasta que al llegar a la confluencia de un río más pequeño, el Carcarañá, halla en esas costas el lugar apto para hacer pie en tierra firme resolviendo desembarcar y construir allí un fuerte al que llamó Sancti Spíritu, que sería el primer asentamiento español en tierra argentina.

Luego de un año de exploraciones por toda la zona sin encontrar la soñada Sierra de la Plata, y acosados por los ataques de los indios, los pobladores resuelven abandonar el fuerte y regresar a España.

Con los relatos llevados por aquellos exploradores a su regreso, estos territorios cobrarían suma importancia para la corona española, no solo por fabulosas riquezas que poseerían estas tierras, sino por la necesidad de ocuparlas para oponer una valla a los portugueses, que no cesaban de avanzar sobre ellos, a pesar de que el Tratado de Tordesillas se los otorgaba a España.

Los colonizadores españoles acometieron entonces la tarea de explorar, tomar posesión del territorio y establecer poblaciones en el actual territorio argentino en los sitios que consideraron estratégicos. Avanzaron desde diferentes lugares de partida tomando tres rumbos bien definidos por los que llevaron poblamiento estable a sendas franjas del territorio.

La primera corriente de población llegó directamente desde España e ingresó por el Río de la Plata siguiendo los pasos de Gaboto. Pedro de Mendoza fue el adelantado que dirigió esta populosa expedición, que contaba con entre mil doscientos y mil quinientos integrantes. Llegaron a las costas del Plata en febrero de 1536 e inmediatamente, allí mismo, Mendoza fundó un fuerte que llamó Santa María de los Buenos Aires. Sin embargo, el entusiasmo inicial que alentaba a esta empresa colonizadora se perdería rápidamente, pues no les fue fácil hallar alimentos para tantos hombres como los que habían venido. Asimismo, las relaciones con los nativos que en un principio fueron buenas, se fueron deteriorando, y los indígenas terminaron sitiando y quemando la fortaleza, poniendo en emergencia la situación de los colonizadores.

Abatido por las circunstancias, Mendoza envió hacia el norte un contingente en busca de provisiones. Este intento colonizador que estaba a punto de fracasar va a dar un giro imprevisto cuando el 15 de agosto de 1537, antes de regresar a Buenos Aires, uno de los exploradores españoles puso las bases de un fuerte al que llamó Nuestra Señora de la Asunción por la festividad religiosa del día. Cuatro años más tarde, en 1541, Domingo Martínez de Irala, la haría oficialmente ciudad instituyendo en ella el primer cabildo en estas tierras. Esta fundación consolidó el dominio español en el Río de la Plata; los sobrevivientes de la fortaleza de Buenos Aires se establecieron allí, formando una población estable donde de la unión de los españoles con mujeres naturales nacieron los primeros criollos de la zona. 

El viejo anhelo de establecer una población en la entrada del Río de la Plata no había desaparecido, es por ello que se encargó a Juan de Garay la fundación de una ciudad en el camino hacia la boca del Plata. Nació así, la ciudad de Santa Fe sobre la margen derecha del río Paraná, junto al río San Javier, en el lugar llamado Cayastá, el 15 de noviembre de 1573. Garay dejó allí un grupo de criollos como sus primeros pobladores. Años más tarde, la ciudad fue trasladada más al sur, rebautizándola con el nombre de Santa Fe de la Vera Cruz.

Siete años más tarde, algunos pobladores asunceños responderían al ofrecimiento de Garay de asentarse en el mismo lugar donde Mendoza había establecido el puerto de Buenos Aires. Viajaron desde Asunción con víveres, herramientas de labranza, semillas, armas y ganado, y el 11 de junio de 1580 Juan de Garay declaró fundada la ciudad de la Trinidad y Puerto de Santa María de los Buenos Aires y designó a los miembros del cabildo.

La segunda corriente colonizadora tuvo como punto de partida el Virreinato del Perú, y su propósito fue avanzar hasta la desembocadura del Río de la Plata.

La primera expedición que ingresó por el norte logró llegar hasta el viejo fuerte Sancti Spíritu fundado por Gaboto, pero un motín de los soldados puso fin a la empresa colonizadora y regresaron al Perú. Aunque esta expedición terminó en fracaso, el largo camino recorrido por los sobrevivientes proporcionó valiosos datos que fueron aprovechados a su regreso por las autoridades.

En 1549, con precisas instrucciones de fundar una ciudad, Juan Nuñez del Prado salió de Potosí, con apenas cien hombres. Un año más tarde, en las cercanías de la actual Tucumán, fundó una población a la cual llamó con el nombre de El Barco, en recuerdo de El Barco de Avila, en España. Esta ciudad será trasladada dos veces: la primera vez fue para evitar problemas de jurisdicción territorial con otros adelantados; y la segunda, en 1552, fue a causa de la constante hostilidad de los indios sobre la población. Sin embargo, esta no sería la última vez: en 1553, Francisco de Aguirre, proveniente de Chile, trasladó a la ciudad de El Barco un poco más al norte y le dio el nombre de Santiago del Estero, tal como se la conoce en la actualidad, constituyendo la más antigua de las ciudades argentinas. Esta zona del Tucumán, de gran extensión puesto que abarcaba todo el actual noroeste argentino, se transformó en una región de encuentro de las expediciones provenientes de Lima, de Asunción y del Río de la Plata. Resultaba por ello de suma importancia la fundación de ciudades allí, que sirvieran de enlace entre tan distantes regiones. Con este objetivo se erigen dos nuevas ciudades: San Miguel de Tucumán y Nueva de Tierra de Promisión, en 1565, y Córdoba de la Nueva Andalucía, en 1573.

El proceso fundacional no se detuvo allí, en 1582 se funda San Felipe de Lerma, hoy Salta; en 1591, la denominada Todos los Santos de la Nueva Rioja, nombre original de la actual ciudad de la Rioja; y un año después en el Valle de Jujuy se funda la actual ciudad homónima, que bautizada en su creación como San Salvador de Velazco.

Con este plan partió una expedición con 38 hombres en 1561. Atravesaron la cordillera de los Andes y tras un mes de caravana llegaron los colonizadores al valle de Huentota y fundaron Mendoza del Nuevo Valle de la Rioja. Al año siguiente, Juan Jufré la hizo trasladar a un sitio más adecuado para la población.  

El mismo Jufré, en 1562, fundó la ciudad de San Juan de la Frontera, cuyo nombre se debe su patrono San Juan Bautista. Posteriormente, el río San Juan arrasó la ciudad y la misma fue trasladada al sur de su primitiva ubicación. 

En agosto de 1594 nace la ciudad de San Luis de Loyola, aunque luego se le cambiaría su denominación por la de San Luis de la Punta de los Venados. De ahí el nombre de “puntanos” con que se conoce a los habitantes de la actual provincia. 

Debe hacerse notar que al producirse la Revolución de 1810, al amparo de estas ciudades originarias y sus radios de influencia, se formaron las primeras provincias argentinas, tomando de aquellas sus nombres.